^a Отделения офтальмологии и визуальных наук, Университет Британской Колумбии, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада
^b Экспериментальная медицина, Университет Британской Колумбии, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада
^c Дипломная программа по неврологии, Университет Британской Колумбии, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада
^d Адрес для переписки: VGH Research Pavilion, 828 W10th Ave., Rm. 386, Vancouver, BC, Canada, V5Z 1L8. Tel.: +604 875 4111x68375; fax: +604 875 4376. E-mail address: cashawlab@gmail.com (C. A. Shaw).

Оригинал здесь

АБСТРАКТ

Синдром войны в Персидском заливе представляет собой мультисистемное расстройство, от которого страдают многие ветераны западных армий, участвовавшие в 1990—1991 годах в войне в Персидском заливе. У большого количества людей с этим синдромом можно наблюдать неврологический дефицит, в том числе различные когнитивные дисфункции и заболевания моторных нейронов, причем эти заболевания проявляются практически неотличимо от классического бокового амиотрофического склероза (БАС), за исключением возраста, в котором болезнь начинает развиваться. Этот "кластер'' БАС — второй кластер БАС, описанный в литературе до настоящего времени. Возможные причины синдрома войны в Персидском заливе включают, среди прочих, и воздействие некоторых адъювантов из вакцин против сибирской язвы. Наиболее вероятным виновником, как представляется, может оказаться гидроксид алюминия. В начальной серии экспериментов мы исследовали потенциальное токсичное воздействие гидроксида алюминия на самцов беспородных CD-1 мышей, которым вводили подкожно две дозы, эквивалентные дозе, получаемой людьми. После умерщвления мышей их спинной мозг и образцы моторной коры были изучены с помощью иммуногистохимии. Получившие алюминий мыши показали значительно усиленный апоптоз моторных нейронов, увеличение плазматических астроцитов и распространение микроглии в спинном мозге и коре головного мозга. С помощью окрашивания морином обнаружено присутствие алюминия в цитоплазме моторных нейронов, причем некоторые нейроны дали также положительный результат в тесте на наличие гиперфосфорилированного тау-белка, что является патологической отличительной чертой различных неврологических заболеваний, включая болезнь Альцгеймера и лобно-височное слабоумие. Вторая серия экспериментов была проведена на мышах, которым вводилось по шесть доз гидроксида алюминия. Анализ поведения этих мышей выявил значительные нарушения многих моторных функций, а также сниженную пространственную память. Продемонстрированная нейротоксичность гидроксида алюминия и его относительно повсеместное применение в качестве адъюванта говорят о том, что оправдана более тщательная проверка этих фактов научным сообществом.

Ключевые слова: гидроксид алюминия, адъювант, нейротоксичность, синдром войны в Персидском заливе, боковой амиотрофический склероз.

1. Введение

В различных исследованиях установлена связь между участием в войне в Персидском заливе (1990—1991 годы) и мультисистемным расстройством, обычно называемым синдромом войны в Персидском заливе (СВ). Среди симптомов СВ — различные неврологические расстройства, в том числе очевидный кластер случаев амиотрофического бокового склероза, БАС [1–4]. Хейли [3] описал классические симптомы БАС, такие как мышечная слабость и истощение, нарушение речи и глотания, трудности с дыханием и подергивание мышц, у ветеранов войны в Персидском заливе, появлявшиеся через год после первых симптомов СВ. Семнадцать из двадцати военнослужащих с диагностированной болезнью войны в Персидском заливе и установленным БАС были моложе 45 лет, а самому младшему было 20 лет. У всех этих 20 пациентов были признаки верхней (моторная кора или бульбарная область) и нижней (спинной мозг) дегенерации моторных нейронов. Ни у одного из этих пациентов в семейной истории не было ни БАС, ни других нейродегенеративных заболеваний. Горнер и соавт. [2] провели общенациональное исследование среди военнослужащих, принимавших активное участие в военных действиях, для определения уровня заболеваемости БАС в течение десятилетия после августа 1990 года. Из примерно 2,5 млн отвечающих этому требованию военнослужащих у 107 были выявлены подтвержденные случаи БАС. В пересчете на среднюю численность населения США в 1990 году средняя ежегодная заболеваемость БАС среди не принимавших участия в военных действиях военнослужащих составила 1,4 на 100 000 человек, в то время как общая заболеваемость населения — 1,5 случаев БАС на 100 000. Заболеваемость БАС среди участвовавших в военных действиях составила 3,6 на 100 000 человек в год. Вайскопф и др. [4] отметили общее увеличение заболеваемости БАС у американских военных, начавшееся за несколько десятилетий до конфликта.

БАС-СВ является одним из всего лишь двух кластеров болезни БАС, удовлетворяющих принятому в настоящее время определению кластера. Второй кластер  — гуамовский вариант БАС, впервые описанный после Второй мировой войны, который называется "комплекс боковой амиотрофический склероз — деменция — паркинсонизм" (БАС-ДП). Этот спектр нарушений, при которых заболеваемость (на острове Гуам. — Прим. перев.) была в сотни раз выше, чем в континентальных Соединенных Штатах [5] (см. для обзора Курлянд, 1988), выражается одним из двух способов. Первый почти совпадает с классической формой БАС, а второй представляет собой одну из форм паркинсонизма, связанную с деменцией, подобно болезни Альцгеймера (ДП). Около 10% жертв имели оба расстройства, но фенотип БАС обычно появлялся первым. Исследования потенциальной этиологии были сосредоточены на факторах окружающей среды, причем наибольшее внимание в конечном итоге было направлено на потребление содержащих токсины семян местной разновидности цикадовой пальмы [6] и высокое содержание алюминия в почве на южном Гуаме [7].

В связи с СВ-БАС, в последнее время было обращено внимание на адсорбированную вакцину против сибирской язвы (AVA) и различные вакцинные компоненты, в частности, известные и подозреваемые адъюванты гидроксид алюминия и сквален [8]. Адъювант — это вещество, добавляемое в процессе производства вакцины и предназначенное для неспецифического повышения иммунного ответа на антиген [9]. То, что соединения алюминия могут служить адъювантами, было обнаружено более 90 лет тому назад. В настоящее время алюминий в различных формах (гидроксид алюминия, фосфат алюминия и сульфат алюминия)  — наиболее часто используемый лицензированный адъювант, причем как фармацевтическая промышленность, так и различные государственные регулирующие органы считают его безопасным [10]. Различные исследования не обнаружили никаких неблагоприятных или долгосрочных последствий для здоровья вследствие использования алюминиевых адъювантов [11–13], и Управление контроля пищевых продуктов и лекарств (FDA) продлило свое давнее разрешение на использование алюминия в такой форме.

Несмотря на долгую историю широкого применения, физико-химические взаимодействия между соединениями алюминия и антигенами изучены относительно слабо, и лежащие в их основе механизмы остаются относительно неизученными [14]. Представляется также, что тщательные исследования на животных потенциальной токсичности алюминиевых адъювантов не проводились. Отсутствие таких исследований кажется странным, учитывая наличие хорошо известных наблюдений, что алюминий в целом может быть нейротоксичным при ряде условий [15, 16], и адъюванты, в частности, были ранее отмечены как влияющие на неврологическое заболевание [17–19]. Табл.  1 показывает результаты предыдущих исследований, в которых рассматривалось воздействие гидроксида алюминия на животных, и перечисляет его воздействия на нервную систему.

Табл. 1 Реузльтаты сравнения симптомов БАС и СВ, наблюдаемых у человека и у мышей и крыс, получивших алюминий. Эта таблица также подчеркивает сходство между БАС у человека и синдромом войны в Персидском заливе.

Что касается использования алюминия в вакцинах, значение ЛД₅₀ для гидроксида алюминия, насколько нам известно, не опубликовано до настоящего времени (Дж. Т. Бейкер, Технические описания паспортов безопасности (Material Safety Data Sheets)).

В литературе также отмечалась потенциальная способность инъекций алюминия вызывать фасциит [20–22].

В предыдущей публикации рассматривалась известная или предполагаемая нейротоксичность нескольких вакцинных адъювантов [8]. В текущем исследовании мы сосредоточимся исключительно на воздействии инъекций гидроксида алюминия на моторные и когнитивные модели поведения и на выражение различных форм невропатологии в модели на мышах in vivo.

2. Экспериментальный метод

2.1 Экспериментальные животные

В нашем первоначальном исследовании [8] использовались молодые (в возрасте 3 месяца) самцы мышей линии CD-1 (весом примерно 35 г. к началу эксперимента). Специально были выбраны более молодые животные, чтобы имитировать типичный возраст службы во время войны в Персидском заливе [3]. Были использованы четыре группы с различным типом инъекций (две инъекции с интервалом в две недели): контрольный солевой / фосфатный буферный раствор (PBS) (n = 10); гидроксид алюминия (n = 11); сквален (n = 10) и гидроксид алюминия и сквален (n = 10). Здесь приводится отчет только о двух группах из этой серии экспериментов: группе получивших алюминий и контрольной группе. Вторая серия экспериментов была проведена на 9-месячных CD-1 мышах, которые получили шесть инъекций гидроксида алюминия в течение двухнедельного периода. Эти мыши, вместе с контрольными и другими экспериментальными группами (отчет будет опубликован в другом месте), подвергались более строгому тестовому поведенческому режиму, который будет описан ниже. Гистологический анализ спинного и головного мозга этих мышей находится в стадии разработки.

Все животные в обоих экспериментах содержались по одному в клетках Научно-исследовательского центра по уходу за животными объектами Джека Белла в Ванкувере, Британская Колумбия, Канада. В течение всего эксперимента поддерживались температура окружающей среды на уровне 22° С и 12/12 часовой световой цикл. Все мыши получали мышиный корм "Пьюрина маус чо" и имели доступ к пище и воде ad libitum.

Мыши из обоих исследований были умерщвлены высокой дозой галотана, после чего им была выполнена транскардиальная перфузия с 4% параформальдегидом (PFA). Для гистологического исследования были взяты ткани ЦНС. Фиксированные ткани головного и спинного мозга всех мышей были на ночь погружены в 30% раствор сахарозы / PBS и затем заморожены, а потом до изготовления срезов хранились при –80° С. Все блоки тканей головного и спинного мозга были помещены в криостат Tissue-Tek для сохранения оптимальной температуры (О.С.Т.) (филиал компании "Сакура" в Зутервуде, Нидерланды), а затем из них в криостате были приготовлены корональные срезы толщиной 30 мкм. Из спинного мозга в поперечной плоскости были сделаны срезы толщиной 25 мкм. Срезы фиксировались с помощью криопротектора (30% этиленгликоля — 20% глицерина — раствор одноосновного и двухосновного фосфата натрия) и хранились до использования в замороженном состоянии при –20° С.

2.2 АДЪЮВАНТЫ

В качестве источника гидроксида алюминия был использован альгидрогель^® — суспензия геля гидроокиси алюминия (Al(OH)₃). Альгидрогель производится компанией Superfos Biosector а/s (Дания) и был куплен у SIGMA (Канада).

2.2.1 ДОЗЫ

Чтобы рассчитать для наших экспериментов получаемую человеком приблизительную дозу гидроксида алюминия, мы использовали следующую информацию. Вакцина для человека против сибирской язвы производится компанией "Байопорт корпорейшн" из Лансинга, Мичиган. В соответствии с продуктовыми спецификациями Мичиганского института биологической продукции (MBPI) (Лансинг, штат Мичиган, США, предшественник "Байопорта"), одна доза вакцины против сибирской язвы содержит 2,4 мг гидроксида алюминия (эквивалентно 0,83 мг алюминия). Исходя из предположения, что в среднем масса тела взрослого человека составляет 70–80 кг, нагрузка на кг массы тела будет составлять приблизительно 30–34 мкг/кг. Солдаты или гражданские лица с прививкой получают 30–34 мкг/кг (одна инъекция) и выше, примерно до 200 мкг/кг, если сделано шесть инъекций. Инъекции адъювантов экспериментальным мышам для обоих экспериментов были откалиброваны на основе среднего веса животных: для 3-месячных самцов CD-1 мышей весом около 35 г и для 9-месячных весом приблизительно 50 г. В первом эксперименте мы делали две инъекции суспензии гидроксида алюминия из расчета 50 мкг/кг, в 200 мкл стерильного PBS (0,9%), с интервалом в две недели. Мыши в этом эксперименте, следовательно, получили 100 мкг/кг по сравнению с вероятными 68 мкг/кг у людей. Во втором эксперименте мыши получали шесть инъекций, в общей сложности 300 мкг гидроксида алюминия/кг в течение двух недель. Контрольные группы в обоих исследованиях получили 200 мкл PBS.

Инъекции человеку делаются как правило подкожно над дельтовидной мышцей. Для инъекций мышам мы использовали подкожную инъекцию в свободную кожу позади шеи, чтобы минимизировать дискомфорт и облегчить введение.

2.3 ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ ТЕСТЫ

В первом исследовании мышей через регулярные интервалы времени подвергали специальным поведенческим тестам моторной и когнитивной функций, в том числе на висячей проволочной сетке (два раза в неделю), на открытом грунте (один раз в неделю) и в водном лабиринте (один раз в неделю) в течение шести месяцев послеинъекционного периода (см. [22]). Порядок, в котором животные тестировались, был рандомизирован для каждого испытания. Во втором исследовании мы провели более подробные поведенческие испытания на основе автоматизированной системы "EthoVision" производства компании информационных технологий "Noldus" (Сиэтл, Вашингтон) с использованием видеокамеры для слежения и программного обеспечения (Noldus EthoVision reg; 3.1). Индивидуальные движения мышей в открытом поле прослеживались в течение пяти минут с недельными интервалами. Программное обеспечение позволило сделать количественные измерения разнообразных двигательных функций, в том числе расстояния перемещения, процента времени в движении, скорости, а также ряда других. Эти последние эксперименты продолжались в течение двадцати восьми недель после последней инъекции.

2.4 ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ (ЭКСПЕРИМЕНТ 1)

2.4.1 NEUN И АКТИВНАЯ КАСПАЗА-3

Как уже отмечалось у Петрика и соавт. [8], в каждую исследуемую группу включили по пять мышей. У каждой мыши было исследовано по несколько срезов из разных сегментов головного мозга (n = 3) и спинного мозга (n = 8). Для определения нейронов и клеток, гибнущих из-за апоптоза, использовались различия в уровнях интенсивности флуоресценции Neun и активированной каспазы-3 соответственно. Множество отбираемых образцов было определено с помощью внутримозговых ориентиров из стереотаксических атласов головного и спинного мозга мышей [23, 24]. Все срезы были подсчитаны беспристрастно под 40-кратным объективом.

2.4.2 ХОЛИНАЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (ChAT) И ГЛИАЛЬНЫЙ ФИБРИЛЛЯРНЫЙ КИСЛЫЙ БЕЛОК (GFAP)

Как уже отмечалось у Петрика и соавт. [8], антитела к ChAT использовались для идентификации холинергических моторных нейронов в головном и спинном мозге [25, 26]. GFAP использовался для маркировки плазматических астроцитов [27, 28].

2.4.3 IBA-1

Поликлональные антитела кролика против связывающей ионизированный кальций адаптерной молекулы 1 (Iba-1) (Wako, Ричмонд, Вирджиния, США) использовались для окрашивания активированной микроглии [29]. Для флуоресцентной иммунномаркировки IBA-1 окрашивание проводилось в соответствии с тем же протоколом, который использовался для маркировки GFAP, за исключением следующих изменений: срезы инкубировали в первичных кроличьих антителах к Iba-1 (в фосфатно-буферном солевом растворе с Tween-20 (PBST) с 1% NGS (нормальная козья сыворотка) + 1% BSA (бычий сывороточный альбумин); разведение 1:1000) в течение ночи при температуре 4° С. Затем срезы инкубировали со вторичными антителами кролика с флуоресцентом AlexaFluor 546^TM (производится фирмой Molecular Probes; Eugene, OR, 1:200) в течение двух часов при комнатной температуре.

2.4.4 МОРИН (3, 5, 7, 2′, 4′-ПЕНТАГИДРОКСИФЛАВОН, BDH)

Морин (в каталоге Sigma номер M4008-2G)  — флуорохром, который образует с алюминием флуоресцентный комплекс, светящийся зеленым цветом (с длиной волны возбуждения 420 нм) [15,30]. Анализ флуоресценции комплекса алюминий-морин был использован в этих экспериментах для визуализации и обнаружения алюминия в поясничном отделе спинного мозга и в других тканях ЦНС. Для окрашивания морином использовался его 0,2% раствор в 85% этиловом спирте, содержащий 0,5% уксусную кислоту.

Все залитые срезы сначала промывались дважды в PBS в течение пяти минут. Затем они обрабатывались в течение десяти минут в 1% водном растворе соляной кислоты, дважды промывались в дистиллированной воде (ddH₂O) по 5 мин. и погружались в 0,2% морин для окраски. После этого срезы промывали дважды в ddH₂O в течение пяти минут, обезвоживали в 70%, 90% и 100%-ом этиловом спирте (этаноле) и очищали 100% ксилолом. Затем все срезы были залиты с помощью заливочной среды Vectashield (Vector Laboratories), зафиксированы прозрачным лаком для ногтей и оставлены для просушки на воздухе.

2.4.5 ОКРАШИВАНИЕ ГИПЕРФОСФОРИЛИРОВАННОГО ТАУ-БЕЛКА

Маркировка гиперфосфорилированного тау-белка (Anti-Human PHF-Tau, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) проводилась с использованием нелюминесцентного метода с диаминобензидином (DAB) в качестве красителя. Микропрепараты с залитыми секциями поясничного отдела спинного мозга вначале дважды промывались в PBS (2 х 5 мин.), прежде чем они были демаскированы с помощью антигена. Эндогенная активность пероксидазы гасилась с помощью использования 0,3% перекиси водорода в метаноле в течение 20 мин. Перед блокировкой секции промывали дважды в PBS (2 х 5 мин.) в блокирующем реагенте M.O.M. (M.O.M. Kit-peroxidase, cat # PK 2200, Vector Laboratoraties, Inc., Burlingame CA) при комнатной температуре в течение одного часа, а затем быстро промывали в PBS и пять минут инкубировали в разбавленном растворе М.О.М. Первичные антитела к PHF-Тау разбавляли 100-кратно в разбавленном растворе M.O.M. и инкубацию проводили при комнатной температуре в течение одного часа. После первичного этапа инкубации антител микропрепараты промывали дважды в PBS, а затем в течение десять минут инкубировали в биотинилированном реагенте M.O.M., содержащем антитела к мышиному иммуноглобулину G (anti-mouse IgG). Перед инкубацией с вторичными антителами срезы промывали в PBS (Vectastain ABC Elite Kit, cat # PK-6101) в течение одного часа при комнатной температуре с последующей инкубацией в реагенте Vectorstain ABC Elite в течение тридцати минут. Микропрепараты снова промывали однократно в PBS. Цветовая доводка была достигнута с использованием раствора Vector ImmPACT^TM DAB (cat # SK-4105). Когда желаемый цвет был получен, микропрепараты промыли в ddH₂O в течение пяти минут и контрастно окрасили в 0,1% метиловом зеленом в течение пяти минут. После контрастного окрашивания микропрепараты были быстро промыты в ddH₂O, а затем их промывали в двух сменах 95% этанола и двух сменах 100% этанола. Микропрепаратам дали высохнуть, прежде чем они были установлены в Permount^® (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ).

2.5 МИКРОСКОПИЯ

Срезы головного и спинного мозга, обработанные флуоресцентными антителами или DAB, изучались под микроскопом Zeiss Axiovert 200 M (Carl Zeiss Canada Limited, Toronto, ON, Canada) при 40-кратном и 100-кратном (с масляной иммерсией) увеличении. Голубое свечение DAPI рассматривалось с использованием поглощающего/излучающего фильтра с чувствительностью 359/461 нм. Alexa Fluor 546^TM (красный) и кроличий IgG DuoLuX^TM (красный) рассматривались с фильтром с чувствительностью 556557/572573 нм. FITC рассматривался с фильтром с чувствительностью 490494/520525 нм. Для гистологии головного мозга и поясничного отдела спинного мозга секции от каждой группы были выбраны случайным образом. При подсчете с использованием 40-кратного увеличения рассматривалось по два изображения каждой секции спинного мозга: вентральное слева и вентральное справа. 40-кратные изображения имели размер 350 х 275 мкм, а 100-кратные изображения имели размер 50 х 115 мкм. Изображения были получены с помощью программного обеспечения AxioVision 4.3.

2.6 КРИТЕРИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИЗМЕРЕНИЯ МАРКИРОВАННЫХ КЛЕТОК

Для определения количества клеток в расчет брались только те клетки, которые попадали в фокус и полностью находились в поле зрения. Чтобы исключить вероятность того, что некоторые клетки могут быть учтены дважды, срезы для каждого гистологического эксперимента были взяты только из одного источника из коллекции образцов, чтобы гарантировать, что срезы удалены не менее чем на 250 мкм друг от друга. Места для отбора подсчитываемых клеток были определены с помощью ориентиров и опорных точек стереотаксических атласов головного и спинного мозга мышей [39, 40].

В спинном мозге рассматривалась только та область вентрального рога, которая содержит клетки, расположенные перед центральным каналом и глубокой бороздой, там, где встречаются серое и белое вещество, а из спинного рога брались клетки только из участка, расположенного позади центрального канала и задней глубокой борозды. Этот критерий применялся независимо от того, какие сегменты спинного мозга рассматривались. В головном мозге подсчитывались только клетки, находящиеся в соответствующих мозговых структурах. Все секции были подсчитаны объективно (кодовый ключ был приписан животным для целей учета и контроля, но он не позволял выявить идентичность при их обработке в соответствии с исследованием).

2.7 СТАТИСТИКА

Значения тестов с индивидуальными заданиями для каждой мыши и подсчитанное количество клеток использовались для вычисления среднего значения ± S.E.M. для каждой группы и состояния. Поведенческие оценки и подсчитанные количества клеток нормализовались относительно среднего значения в контрольных группах. Средние сравнивали с помощью одно- или двухфакторного дисперсионного анализа (пакет Statistica, Statsoft Inc., Tulsa, OK; Graph-Pad Prism, San Diego, CA).

3. Результаты

В отличие от исследования Петрика и соавт. [8], которое показало уменьшение ChAT-положительных моторных нейронов в поясничном отделе спинного мозга у получивших гидроксид алюминия мышей, не было никакого существенного различия в ChAT-маркировке или подсчете моторных нейронов ни в шейном, ни в грудном сегменте спинного мозга (рис. 1, А и В). Тем не менее группа, получившая инъекции алюминия, показала весьма значительное увеличение экспрессии GFAP-положительных астроцитов (70%) по сравнению с контрольной группой (принятой за 100% на всех графиках; рис. 1, С), в шейном сегменте спинного мозга. Эти результаты относительно GFAP зеркально отражают результаты, о которых сообщалось ранее, относительно поясничного отдела спинного мозга.

Рис. 1. Воздействие гидроксида алюминия на различные сегменты спинного мозга. На графиках отображены данные по двум группам: контрольной и получившей инъекции гидроксида алюминия. Графики А и В — маркировка с помощью ChAT, С и D — маркировка GFAP для подсчета плазматических астроцитов. Подсчитывалось нормализованное количество положительно маркированных клеток в образце из шейного (А и С) и грудного (В и D) отделов спинного мозга соответственно. Получившие гидроксид алюминия группы показали в шейном отделе более высокие уровни GFAP-маркировки по сравнению с группой, получившей только алюминий, на статистически значимом уровне отличия. На графике E видно, что при флуоресцентной маркировке Iba-1 клеток из вентрального рога поясничного отдела спинного мозга, у мышей, получивших инъекции алюминия, было значительно увеличено количество активированных микроглиальных клеток. На графиках показаны средние значения ± S.E.M. ***р < 0,001, однофакторный метод дисперсионного анализа ANOVA.

Маркировка Iba-1 продемонстрировала значительно увеличенные уровни активированной микроглии в поясничном отделе спинного мозга животных, которым вводили алюминий (111%), по сравнению с контрольной группой (рис. 1, E). Другие сегменты позвоночника в настоящем исследовании на микроглию не проверялись.

Только мыши, которым вводили гидроксид алюминия, показали значительно увеличенное количество клеток, маркированных морином, в поясничном отделе спинного мозга, по сравнению с другими группами (рис. 2, A—E).

Рис. 2 Флуоресцентная маркировка морином в вентральном роге поясничного отдела спинного мозга мышей. А — срезы мозга мышей из контрольной группы не показывают окрашивания при флуоресцентной маркировке морином. Размер 1 бара = 20 мкм. В — морин-позитивные моторные нейроны у мышей, получивших гидроксид алюминия. С и D — повышенная мощность моторных нейронов у мышей, получивших инъекции алюминия, приводит к высокому уровню цитоплазматической маркировки морином. Размер 1 бара = 20 мкм. E — нормализованное число морин-позитивных клеток в различных экспериментальных группах (n = 4 мыши/на группу, четыре среза от каждой). Показаны средние значения ± S.E.M. Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA показал уровень значимости *р < 0,05.

Аналогично, только у мышей, получивших инъекции алюминия, был обнаружен аномальный белок тау в моторных нейронах из поясничного отдела спинного мозга (рис. 3). Другие отделы позвоночника не проверялись в настоящем исследовании ни на окрашивание морином, ни на наличие тау-белка.

Рис. 3 Иммуноокрашивание гиперфосфорилированного тау-белка в вентральном роге поясничного отдела спинного мозга мыши по сравнению с болезнью Альцгеймера. А  —  срез из энторинальной коры человеческого мозга от пациента из группы контроля. B — срез из энторинальной коры мозга пациента с болезнью Альцгеймера (срезы любезно предоставлены компанией д-ра П. Mакгира). C — образец из поясничного отдела спинного мозга мыши, получившей солевой раствор (физраствор). D — эквивалентный срез из мозга мыши, получившей гидрооксид алюминия. Все фотографии увеличены 100-кратно.

Множественные инъекции гидроксида алюминия во втором эксперименте показали глубокое воздействие на моторное и другие виды поведения, что показано на рис. 4 и 5. Множественные инъекции алюминия вызывали значительные поведенческие изменения, в том числе и в локомоторном поведении (рис. 4), и в снижении памяти, проявляющиеся при выполнении заданий в водном лабиринте (рис. 5). Другие поведенческие измерения, в том числе мышечная сила и выносливость, проверяемые в висе на проводе, моторная координация и баланс, измеряемый на ротароде, существенно не изменились.

Рис. 4 Анализ движения в открытом поле для сравнительной оценки спонтанной активности и тревожности у контрольных мышей и мышей, которым шестикратно вводили гидроксид алюминия. Мыши, получившие инъекции гидроксида алюминия, показали следующие изменения в поведении: А — перемещения на более короткие расстояния (***p < 0,0001), В — более медленное движение (*** р < 0,0001), C — больший средний угол поворота (***р < 0,0001), D — более быстрый поворот (***р < 0,0001), E — более крутой меандр (***р < 0,0001), F — меньший процент времени нахождения в движении относительно общего времени наблюдения (**р = 0,0030), G — меньше выходов в центр открытого поля (***р < 0,001), H — более поздний выход в центр (***р < 0,0001). (Все измерения обработаны с помощью двухфакторного дисперсионного анализа АNOVA).

Рис. 5. Испытание в водном лабиринте для оценки обучаемости и памяти. Мышам, получившим шестикратно инъекцию гидроксида алюминия, в среднем потребовалось значительно больше времени для прохождения лабиринта по сравнению с мышами, которым вводили солевой раствор (двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA, *р = 0,0389).

4. Обсуждение

Полученные результаты дополняют предварительные результаты, сообщенные Петриком и соавт. [8], и показывают, что активация микроглии является частью возникающей в поясничном отделе спинного мозга патологии. Эти данные добавляются к тем, о которых сообщалось ранее, т. е. о потере двигательных и других нейронов и об активации плазматических астроцитов. Совокупность полученных данных об общей активации глиального воспалительного ответа в поясничном отделе спинного мозга позволяет предположить, что этот процесс является ключевой ранней стадией патологических событий, ведущих к гибели моторных нейронов. Эта интерпретация поддерживается отсутствием в текущем исследовании потери двигательных нейронов и активации астроцитов в других отделах спинного мозга. При БАС и в животных моделях болезни глиальная активация, за которой следует гибель моторных нейронов, часто происходит в последовательном порядке вдоль вентральной части спинного мозга, и начало этого процесса совпадает с первыми признаками патологии, проявляющейся первоначально в поясничном отделе спинного мозга [31]. Учитывая это, представляется возможным, что поздние патологические реакции могут быть обнаружены также в грудном и шейном отделах. С другой стороны, алюминий, присутствие которого обнаружено в моторных нейронах поясничного отдела спинного мозга, мог еще не достигнуть других отделов спинного мозга. Проводимое сейчас исследование определит с помощью маркировки, содержат ли алюминий моторные нейроны из других отделов.

Положительное окрашивание морином в поясничном отделе наглядно демонстрирует, что после инъекции алюминий поступает в эту часть нервной системы. Одна возможность заключается в том, что это происходит благодаря ретроградному транспорту из мышц в моторные нейроны определенных отделов. Это выглядит маловероятным, учитывая, что наш метод метод подкожных инъекций не предусматривал какой-либо конкретный отдел спинного мозга в качестве мишени. Другая возможность заключается в том, что алюминий может проникнуть в ЦНС системным образом, если он попадает в кровеносную систему. Проводимый в настоящее время эксперимент предназначен различить между этими двумя возможностями.

Присутствие гиперфосфорилированного тау-белка в моторных нейронах поясничного отдела спинного мозга является одним из признаков обоих заболеваний — болезни Альцгеймера и гуамовского синдрома БАС-ДП — и ясно показывает, что происходят дополнительные патологические процессы, связанные с алюминием.

Поведенческие результаты второго эксперимента, о которых здесь сообщалось, усилили патологические последствия, полученные в первом эксперименте. Хотя гистологические измерения из второго эксперимента еще не получены, степень нарушений поведения позволяет предположить, что мы будем наблюдать широкую нейронную патологию. Больший объем поведенческих результатов в этом эксперименте может быть связан с его парадигмой, в соответствии с которой утроено количество инъекций гидроксида алюминия.

В целом, результаты, представленные здесь, являются зеркальным отражением предыдущей работы, которая ясно продемонстрировала, что алюминий как в оральной, так и в инъекционной форме, может быть нейротоксичным [15, 16, 32, 33]. Потенциальный механизм токсического действия алюминия может включать в себя усиление воспаления (например, микроглиоз) и вмешательство в холинергические проекции [34], снижение утилизации глюкозы [33], дефектные реакции фосфорилирования-дефосфорилирования [35], изменение скорости трансмембранной диффузии и селективные изменения в насыщаемой транспортной системе в гематоэнцефалическом барьере (ГЭБ) [36] и окислительное повреждение клеточных процессов из-за ингибирования окислительно-восстановительного цикла глутатиона [37].

Учитывая вышесказанное, неудивительно, что алюминий рассматривается многими в качестве одного из факторов, вызывающих нейродегенеративные заболевания, и связь которого с дегенеративными нейронами в специфических областях ЦНС [38–41] была обнаружена. В исследованиях на животных наблюдались связь алюминия с накоплением тау-белка и бета-амилоидного белка и обусловленный алюминием апоптоз нейронов как in vivo, так и in vitro [30]. Животные, получившие инъекции алюминия, показывают тяжелую антероградную дегенерацию окончаний холинергических нервов в коре и гиппокампе [42].

Алюминий в своей адъювантной форме может получить доступ к ЦНС [42–44], однако пероральное введение геля гидроксида алюминия не оказалось нейротоксичным для человека [45], хотя хлорид алюминия нейротоксичен для крыс [[46]. Путь воздействия и, возможно, форма алюминия могут быть важными факторами, которые определяют потенциал токсичности.

Мы полагаем, что наблюдавшееся в настоящем исследовании нейротоксическое действие гидроксида алюминия осуществляется как по "прямым", так и по "косвенным" путям, и некоторые из них были приведены выше. Прямая токсичность относится к физическому присутствию алюминия (или происходит в непосредственной близости от него) и его способности к инициализации путей гибели клеток. Накопление алюминия в цитоплазме посредством клеточных механизмов поглощения или диффузии может вызвать изменения в глутаминазе и глютаминсинтетазе и легко изменить доступность нейротрансмиттера глутамата [47]. Действие алюминия, вызывающего ненормальное накопление тау-белка, также может способствовать увеличению нейрофибриллярных клубков и повреждать механизмы клеточного транспорта [48]. Вне клетки алюминий может повлиять на нейроны, изменяя синапсы. Например, было показано, что алюминий уменьшает толщину постсинаптического уплотнения, увеличивает ширину синаптической щели и увеличивает число плоских синапсов [49]. Алюминий может также блокировать напряженно-активированные кальциевые каналы [50], увеличивать активность ацетилхолинэстеразы [51] или вмешиваться в синаптическую передачу, просто накапливаясь в синаптической щели [52]. Алюминий также может индуцировать апоптоз в астроцитах [53]. Так как астроциты необходимы для поддержания нейронов в здоровом состоянии, любое снижение функции астроцитов может оказаться токсичным для нейронов. Косвенная токсичность алюминия может осуществляться различными способами, в том числе путем активации различных цитокинов [54], освобождающих глутамат в экситоксическом каскаде, или путем изменения различных ферментативных путей [55].

В дополнение к отмеченному выше специфическому воздействию на нервные клетки, алюминий может действовать опосредованно, стимулируя анормальный распространенный иммунный ответ. В первую очередь для этого адъюванты и помещаются в вакцины. Адъювантная нейротоксичность может быть, таким образом, результатом несбалансированного иммунного ответа. Рук и Зумла [56] предположили, что многочисленные прививки, стресс и метод вакцинации могут привести к сдвигу в иммунном ответе [56, 57]. Гидроксид алюминия, как было ранее показано, стимулирует ответ Th2-цитокинов [9 , 58].

В то время как текущее исследование и наши предыдущие эксперименты показали значительные поведенческие и нейропатологические результаты воздействия гидроксида алюминия и некоторые дополнительные значительные результаты действия комбинаций адъювантов, важно понимать, что это было достигнуто при минимальных условиях. Табл. 1 обобщает аспекты симптомов БАС и СВ у человека в сравнении с результатами, наблюдаемыми у получивших инъекции алюминия мышей. Существует вероятность, что возникает синергический эффект между вспомогательными веществами и другими переменными, такими как стресс, многочисленные прививки и воздействие других токсинов. Недавнее исследование, в котором изучались сочетания некоторых из этих факторов, показали, что стресс, вакцинация и бромид пиридостигмина (ингибитор антихолинэстеразы (АХЭ) карбаматного типа) может синергично действовать на множественные стресс-активированные киназы в головном мозге, вызывая неврологические нарушения при СВ [59]. Кроме того, генетический фон в контексте воздействия алюминия может играть решающую роль и стать важной областью для будущих исследований.

Демонстрация нейропатологических результатов и поведенческих дефицитов, вызванных у мышей инъекциями гидроксида алюминия, может не только дать некоторое представление о причинах БАС-СВ, но показывает возможные направления исследования других неврологических заболеваний.

5. Сокращения

ЭТИЧЕСКОЕ РАЗРЕШЕНИЕ НА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ

Протоколы, регулирующие использование животных, были утверждены Комитетом по этике Университета Британской Колумбии и соответствовали инструкциям, опубликованным Канадским советом по уходу за животными, и международным рекомендациям, в том числе "Руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию" Национального института здоровья (NIH), а также Директиве Совета ЕЭС.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Никто из авторов не получал гранты или финансирование от Bioport, Chiron, Corixa или какой-либо иной фармацевтической компании, упомянутой в этой статье.

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа была поддержана грантами Благотворительного фонда Шотландского обряда Канады и Канадским советом по естественным наукам и техническим исследованиям при Канадской академии наук. Мы благодарим д-ра Мерил Несс (Маунт Дезет Айленд Госпитал, штат Мэн, США) и подполковника Джона А. Ричардсона (USAFR, в отставке) за их неоценимые комментарии и консультативный вклад в этот проект и рукопись.

ПРИМЕЧАНИЯ

[1] F. Charatan, BMJ 324 (2002) 65.
[2] R.D. Horner, K.G. Kamins, J.R. Feussner, S.C. Grambow, J. Hoff-Lindquist, Y. Harati, H. Mitsumoto, R. Pascuzzi, P.S. Spencer, R. Tim, D. Howard, T.C. Smith, M.A. Ryan, C.J. Coffman, E.J. Kasarskis, Neurology 61 (2003) 742–749.
[3] R.W. Haley, Neurology 61 (2003) 750–756.
[4] M.G. Weisskopf, E.J. O’Reilly, M.L. McCullough, E.E. Calle, M.J. Thun, M. Cudkowicz, A. Ascherio, Neurology 64 (2005) 32–37.
[5] L.T. Kurland, Trends Neurosci. 11 (1988) 51–54.
[6] M.G. Whiting, Econ. Bot. 17 (1963) 271–302.
[7] R.M. Garruto, S.K. Shankar, R. Yanagihara, A.M. Salazar, H.L. Amyx, D.C. Gajdusek, Acta Neuropathol. Berl. 78 (1989) 210–219.
[8] M.S. Petrik, M.C. Wong, R.C. Tabata, R.F. Garry, C.A. Shaw, Neuromol. Med. 9 (2007) 83–100.
[9] J.M. Brewer, M. Conacher, C.A. Hunter, M. Mohrs, F. Brombacher, J. Alexander, J. Immunol. 163 (1999) 6448–6454.
[10] E.B. Lindblad, Vaccine 22 (2004) 3658–3668.
[11] N.W. Baylor, W. Egan, P. Richman, Vaccine 20 (Suppl. 3) (2002) S18–S23.
[12] G. Kanra, S. Viviani, K. Yurdakok, E. Ozmert, A. Anemona, S. Yalcin, O. Demiralp, N. Bilgili, A. Kara, A.B. Cengiz, B. Mutlu, A. Baldini, E. Marchetti, A. Podda, Pediatr. Int. 45 (2003) 314–318.
[13] T. Jefferson, M. Rudin, C. Di Pietrantonj, Lancet Infect. Dis. 4 (2004) 84–90.
[14] E.B. Lindblad, Immunol. Cell Biol. 82 (2004) 497–505.
[15] D.R. Crapper, S.S. Krishnan, A.J. Dalton, Science 180 (1973) 511–513.
[16] M. Kawahara, M. Kato, Y. Kuroda, Brain Res. Bull. 55 (2001) 211–217.
[17] R.M. Garruto, R. Yanagihara, D.C. Gajdusek, Neurology 35 (1985) 193–198.
[18] M. Wagner-Recio, A.D. Toews, P. Morell, J. Neurochem. 57 (1991) 1891–1901.
[19] A. Bilkei-Gorzo, Food Chem. Toxicol. 31 (1993) 357–361.
[20] F. Verdier, R. Burnett, C. Michelet-Habchi, P. Moretto, F. Fievet-Groyne, E. Sauzet, Vaccine 23 (2005) 1359–1367.
[21] R.K. Kalil, A. Monteiro Jr, M.I. Lima, E.B. Silveira, F.S. Foltran, C.E. Martins, I.M. Rizzo, Ultrastrct. Pathol. 31 (2007) 45–50.
[22] C. Exley, L. Swarbrick, R.K. Gherardi, F.J. Authier, Med. Hypotheses 72 (2009) 135–139.
[23] R.L. Sidman, J.B. Angevine Jr., E.T. Pierce, Atlas of the Mouse Brain and Spinal Cord, Harvard University Press, Massachusetts, 1971.
[24] G. Paxinos, K.B.J. Franklin, The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, second ed., Academic Press, San Diego, 2001.
[25] R. Wetts, J.E. Vaughn, Exp. Neurol. 141 (1996) 248–255.
[26] A. Maatkamp, A. Vlug, E. Haasdijk, D. Troost, P.J. French, D. Jaarsma, Eur. J. Neurosci. 20 (2004) 14–28.
[27] V.M. Lee, C.D. Page, H.L. Wu, W.W. Schlaepfer, J. Neurochem. 42 (1984) 25–32.
[28] T. Tohyama, V.M. Lee, L.B. Rorke, J.Q. Trojanowski, J. Comp. Neurol. 310 (1991) 285–299.
[29] Y. Imai, I. Ibata, D. Ito, K. Ohsawa, S. Kohsaka, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996) 855–862.
[30] U. De Boni, J.W. Scott, D.R. Crapper, Histochemistry 40 (1974) 31–37.
[31] R.C. Tabata, J.M.B. Wilson, P. Ly, P. Zwiegers, D. Kwok, J.M. Van Kampen, N. Cashman, C.A. Shaw, Neuromol. Med. 10 (2008) 24–39.
[32] W.A. Banks, A.J. Kastin, Neurosci. Biobehav. Rev. 13 (1989) 47–53.
[33] J.G. Joshi, Biofactors 2 (1990) 163–169.
[34] B. Platt, G. Fiddler, G. Riedel, Z. Henderson, Brain Res. Bull. 55 (2001) 257– 267.
[35] J.M. Cordeiro, V.S. Silva, C.R. Oliveira, P.P. Goncalves, J. Inorg. Biochem 97 (2003) 132–142.
[36] M. Kaya, R. Kalayci, N. Arican, M. Kucuk, I. Elmas, Biol. Trace Elem. Res. 92 (2003) 221–230.
[37] N.J. Murakami, J. Neurol. 256 (Suppl. 2) (1999) II16–II18.
[38] D.P. Perl, D.C. Gajdusek, R.M. Garruto, R.T. Yanagihara, C.J. Gibbs, Science 217 (1982) 1053–1055.
[39] D.P. Perl, W.W. Penderbury, Can. J. Neurol. Sci. 13 (1986) 441–445.
[40] J.K. Rao, C.D. Katsetos, M.M. Herman, J. Savory, Clin. Lab. Med. 18 (1998) 687– 698.
[41] J. Savory, R.M. Garruto, Nutrition 14 (1998) 313–314.
[42] G.Y. Wen, H.M. Wisniewski, Acta Neuropathol. (Berl) 68 (1985) 175–184.
[43] K. Redhead, G.J. Quinlan, R.G. Das, J.M. Gutteridge, Pharmacol. Toxicol. 70 (1992) 278–280.
[44] G. Sahin, I. Varol, A. Temizer, K. Benli, R. Demirdamar, S. Duru, Biol. Trace Elem. Res. 41 (1994) 129–135.
[45] G. Rosati, P. De Bastiani, P. Gilli, E. Paolino, J. Neurol. 223 (1980) 251– 257.
[46] J.R. Walton, Neurosci. Lett. 412 (2007) 29–33.
[47] H. R. Zielke, M.J. Jackson, J.T. Tildon, S.R. Max, Mol. Chem. Neuropathol. 19 (1993) 219–233.
[48] A. Bizzi, R.C. Crane, L. Autilio-Gambetti, P. Gambetti, J. Neurosci. 4 (1984) 722– 731.
[49] Y. Jing, Z. Wang, Y. Song, Synapse 15 (2004) 292–298.
[50] D. Busselberg, B. Platt, H.L. Haas, D.O. Carpenter, Brain Res. 622 (1993) 163–168.
[51] P. Zatta, M. Ibn-Lkhayat-Idrissi, P. Zambenedetti, M. Kilyen, T. Kiss, Brain Res. Bull. 59 (2002) 41–45.
[52] E. Banin, H. Meiri, Brain Res. 423 (1987) 359–363.
[53] D.A. Aremu, S. Meshitsuka, Brain Res. 1031 (2005) 284–296.
[54] V.J. Johnson, R.P. Sharma, Neurotoxicity 24 (2003) 261–268.
[55] P. Nayak, A.K. Chatterjee, Food Chem. Toxicol. 39 (2001) 1285–1289.
[56] G.A. Rook, A. Zumla, Lancet 349 (1997) 1831–1833.
[57] G.A. Rook, A. Zumla, Hosp. Med. 59 (1998) 10–11.
[58] J.P. Valensi, J.R. Carlson, G.A. Van Nest, J. Immunol. 153 (1994) 4029–4039.
[59] D. Wang, G. Perides, Y.F. Liu, J. Neurochem. 93 (2005) 1010–1020.